МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ ПЛОДОВ И ОВОЩЕЙ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНА ПАТУЛИНА

С. 2 ГОСТ 28038-89

Колба плоскодонная по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см³.

Воронка лабораторная по ГОСТ 25336 диаметром 56 мм высотой 80 мм.

Колба грушевидная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом ^,4Л.з вместимостью 100 см³. Колба остродонная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом ^|4/гз вместимостью 25 см³. Пипетка с делениями по ГОСТ 29227 исполнения 6 или 7 вместимостью 10 см³.

Пипетка с делениями по ГОСТ 29227 исполнения 4 или 5 1-го класса точности вместимостью 1 см³.

Эксикатор по ГОСТ 25336 с краном, с диаметром корпуса 250 мм.

Вставка для эксикатора по ГОСТ 9147 диаметром 230 мм исполнения 2.

Воронка капельная по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см³.

Распылитель стеклянный с грушей.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Вата по ГОСТ 5556.

Силикагель Л. 100—160 или 100—250 мкм. фирма Лахема. ЧССР.

Пластинки для тонкослойной хроматофафии «Силуфол» 15×15 см. фирма Какалиер, ЧССР. Па тулин по НТД.

Хлороформ технический по ГОСТ 20015 высшего сорта свеженерегнанный.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Кислотая соляная по ГОСТ 3118. х. ч.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207. х. ч.. раствор концентрации 150 г/дм³ (раствор Карреза 1).

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823. ч. д. а., раствор концентрации 300 г/дм³ (раствор Карре за II).

Эфир этиловый уксусной кислоты по ГОСТ 22300. ч. д. а. (этилацетат).

Ацетон но ГОСТ 2603. х. ч.

Толуол по ГОСТ 5789. ч. д. а.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5848. ч. д. а.

Бензидин. ч. д. а., раствор в муравьиной кислоте концентрацией 5 г/дм³.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233. х. ч.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166. прокаленный, х. ч.

Калий марганцовокислый по ГОСТ 20490. х. ч.. раствор концентрацией 15 г/дм³.

Вода дистиллированная но ГОСТ 6709.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 230 мм и внутренним диаметром 25 мм. Калий двухромовокислый по НТД или ГОСТ 4220. ч.

Кислота серная концентрированная по ГОСТ 4204. р₂₀ ⁼ 1R36 кг/м³.

Бензол по ГОСТ 5956. ч. д. а., перегнанный.

Ацетонифил по НТД. ч.. перегнанный.

(Измененная редакция. Изч. № I, 2).

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1. Т р е б о в а н и я безопасности при проведении испытания Помещение, в котором проводится определение патулина. должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с хлором следует проводить в вытяжном шкафу лаборатории с использованием индивидуальных средств зашиты (резиновые перчатки, злицгтные очки, фильфуюшие респираторы РИГ-67-В или РУ-60 МВ), а также с соблюдением правил личной гашены.

4.1а. Калибровка спектрофотометра

Готовят растворы двухромовокислого калия с (К₂Сг₂0₇) = 0.25 • 10“³ моль/дм³. с (К₂Сг₂0₇) = = 0.125 10~³ моль/дм³. с (К₂Сг₂0₇) = 0.625 • 10~³ моль/дм³ в растворе серной кислоты с (j H₂S0₄) = = 0.018 моль/дм³.

Раствор серной кислоты готовят следующим образом. В мерную колбу вместимостью 2000 см ³ пипеткой вносят I см³ серной кислоты и доводят объем водой до метки. (Допускается использовать мерную колбу вместимостью 1000 см³, соответственно уменьшив вдвое объем серной кислоты). Кашбровочный раствор с (К₂Сг₂0₇) — 0.25- 10~³ моль/дм³ готовят следующим образом: 78 мг двухромонокислого калия вносят в мерную колбу вместимостью 1000 см ³, растворяют в 100—200 см³

140

ГОСТ 28038-89 С. 3

раствора серной кислоты и доводят до метки раствором серной кислоты той же концентрации. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Остальные калибровочные растворы готовят точным разведением первого раствора в 2 и в 4 раза раствором серной кислоты.

Определяют оптическую плотность каждого раствора в кювете с рабочей длиной 1 см на спектрофотометре при длине волны 350 нм. В качестве контрольного раствора используют раствор серной кислоты. По полученным значениям оптической плотности для каждого раствора вычисляют значение малярного показателя поглощения (Е), дм³ моль^-1 • см^-1, по формуле

где D — оптическая плотность калибровочного раствора;

с — молярная концентрация двухромовокислою калия в растворе, моль/дм³;

/ — рабочая длина кюветы, см.

По полученным значениям рассчитывают среднее значение молярного показателя поглощения (£) и вычисляют поправочный коэффициент (К ) для спектрофотометра по формуле

где Е_с — стандартизованное значение молярного показателя поглощения.

Е_с — 3160 дм³ • моль^-1 • см^-1.

(Введен дополнительно. Изм. № 2).

4.2. Приготовление первого стандартного раствора

В сосуд с натулином. содержащий около 5 мг препарата, вносят пипеткой 10 см³ смеси бензола с ацетонитрилом (9 : 1). Содержимое сосуда аккуратно взбалтывают до полного растворения кристаллов патулина и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. Сосуд ополаскивают еще двумя порциями по 10 см³ смеси бензола с ацетонитрилом (9 : I). каждый раз перенося содержимое в ту же мерную каабу. Объем в колбе доводят до метки смесью бензола с ацетонитрилом (9 : 1). содержимое тщательно перемешивают. 20 см³ полученного раствора переносят в другую мерную колбу такой же вместимости. Объем в колбе доводят до метки смесью бензола ацетонитрилом (9 : 1). содержимое тщательно перемешивают. Полученный первый стандартный раствор хранят в холодильнике в закрытом сосуде. Срок годности раствора патулина — 6 мес.

Точную концентрацию патулина в первом стандартном растворе определяют спсктрофотомст-рнческим методом. Для этою пипеткой 6.0 см³ первого стандартною раствора переносят в отгонную колбу. Раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35—40 °С. Сухой остаток растворяют в 9.0 см³ этилового спирта и определяют оптическую плотность слоя раствора в кювете с рабочей длиной 1 см по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре при длине волны 275 нм. В качестве контрольного раствор;! используют этиловый спирт.

Массовую концентрацию патулина в стандартном растворе (О. мкг/ем³, вычисляют по формуле

где М — молярная масса патулина. М = 154 г/моль;

D — оптическая плотность раствор;!;

А’| — коэффициент разведения. АТ, = 1.5;

*2 — поправочный коэффициент к спектрофотометру, определенный по п. 4.1а; е — молярный показатель поглощения раствора патулина при длине волны 275 нм.

£ = 1.46 10⁴ дм³ моль^-1 • см^-1 ;

/ — рабочая длина кюветы, см.

4.3. Приготовление второго стандартного раствора Второй стандартный раствор патулина готовят точным разведением первого стандартною раствора смесью бензола с ацетонитрилом (9 : I) в два раза.

4.2. 4.3. (Измененная редакция. Изм. № 2).

141

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

5.1.    Приготовление водной вытяжки из образца

Навеску соков, пюре, напитков массой 50.0 г или повидла, джема, варенья, фруктового порошка массой 25.0 г помешают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³. В мерную колбу вносят 15 см³ раствора Карреза I и 15 см³ раствор;» Карре за II. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Собирают 50 см³ фильтрата.

5.2.    Экстракция

Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку. Этим же цилиндром отмеряют 50 см³ этилацетата, переносят его в делительную воронку и в течение I мин интенсивно перемешивают содержимое. Смеси дают отстояться и после полного разделения водный нижний стой сливают обратно в цилиндр, а этилацетатный экстракт переносят в сухую плоскодонную колбу. Экстрагирование остатков патулина из водной фазы проводят еще раз в аналогичных условиях свежей порцией этилацетата. При этом после одноминутного перемешивания в делительную воронку вносят 10 г хлористого натрия и продолжают перемешивать еше в течение 0.5 мин. Посте разделения слоев водную фазу отбрасывают, а объединенные этилацетатные экстракты высушивают в плоскодонной колбе при добавлении 15—20 г сернокислого натрия. Посте высушивания экстракт фильтруют через ватный тампон в отгонную грушевидную колбу. Оставшийся сернокислый натрий ополаскивают 10 см³ этилацетата. которые затем также фильтруют в отгонную колбу. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре 35—40 °С до объема окало I см³.

5.3.    Очистка экстракта

На дно стеклянной каюнки помещают ватный тампон, поверх которого насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм. В колонку вносят суспензию 2 г силикагеля в 15 см³ бензола. Не давая просохнуть слою силикагеля, поверх него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10 мм. Бензолу дают стечь, nocie чего на верхний слой сернокислого натрия наносят экстракт. Экстракту дают полностью впитаться в фильтрующий слой. Отгонную колбу ополаскивают 0.5 см³ этилацетата. смыв переносят на колонку и дают ему полностью впитаться в фильтрующий слой.

В колонку вносят 25 см³ бензола, дают ему полностью пройти через фильтрующий слой, выходящий элюат отбрасывают. В колонку вносят 100 см³ смеси бензола с этилацетатом (3 : 1). С этого момента начинают отбирать выходящий элюат. После прекращения выхода растворителя из калонки элюат переносят в остродонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35—40 °С. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0.2 см³ смеси бензола с ацетонитрилом (9:1) для анализа методом тонкослойной хроматографии или в 0.2 см³ этилового спирта для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

5.4.    Хроматографическое разделен ие

Пластинку «Силуфол» на расстоянии 2 см от краев размечают тонкими карандашными линиями. В точку пересечения линий в правом нижнем углу наносят с помощью мпкрошприца

0.02 см³ исследуемого раствора. В нравом верхнем и левом нижнем углах на стартовых линиях отмечают по три точки, в которые микрошприцем наносят рахличные объемы первого стандартного раствора патулина. Количество патулина в пятнах должно быть от 10 до 80 нг. Пластинку одной из стартовых линий вниз помешают в камеру для тонкослойной хроматографии, предварительно заполненную смесью хлороформ-ацетон (4:1) на высоту около 1 см. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат до исчезновения запаха растворителя. Высушенную пластинку помещают второй стартовой линией вниз в камеру для тонкослойной хроматофафии. предварительно заполненную смесью толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:4: I) на высоту окало I см. Проводят развитие хроматограммы во втором направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат до исчезновения запаха растворителя.

5.2—5.4. (Измененная редакция, Изм. № 2).

5.5.    Обнаружение патулина

На вставку эксикатора ставят стеклянный стакан вместимостью 150 см³ с 25 см³ раствора марганцовокислого калия, рядом помешают хроматофафичсскую пластинку. Эксикатор плотно закрывают крышкой и к раствору марганцовокислого калия по каплям приливают 25 см³ соляной кислоты из капельной воронки, вставленной в отверстие крышки эксикатора. По истечении 15 мин пластинку извлекают из эксикатора, оставляют еше на 10 мин в вытяжном шкафу, а затем опрыскивают из распылителя раствором бензидина. Хроматографическую пластинку сушат в токе

142

ГОСТ 28038-89 С. 5

холодного воздуха под тягой в течение 15—20 мин. Хроматограмму рассматривают » ультрафиолетовом свете. Патулин обнаруживается в виде желтых флуоресцирующих пятен. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности пятнам стандартною раствора патулнна. свидетельствует о его наличии в анализируемом продукте. Количество патулина в пятне анализируемой пробы определяют, сравнивая размер и интенсивность флуоресценции пятен стандартного патулина и пятен патулина в анализируемой пробе.

6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Массовую долю патулина (л) в процентах вычисляют но формуле

т

т V, У₄

где т| — количество патулина. обнаруженное в пятне, нг;

общий объем, до которого доведена навеска при прибавлении к ней воды, см³; общий объем хлороформного экстракта, см³ ; масса навески продукта, г; объем фильтрата, отобранный на анализ, см³; объем хлороформного экстракта, наносимый на пластинку, см³ .

За результат анализа принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений. расхождение между которыми нс должно превышать 20 10~⁷ %.

Если найденное значение массовой доли патулина в анализируемой пробе отличается от установленной нормы более чем на 10 10^-7 %. его принимают за окончательный результат. Если равно или менее 10 I0^-7 %, то следует провести повторное хроматографическое разделение на пластинке. При этом в точки на стартовых линиях необходимо наносить такие объемы второго стандартного раствора патулина. чтобы количество в них патулина максимально приближалось к количеству патулина в пятне анализируемой пробы при ее нанесении в том же количестве, что и в предыдущем случае.

7. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

7.1.    Сущность метода

Метод основан на экстракции патулина из продукта органическим растворителем, очистке экстракта от мешающих веществ и определением патулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматофафии. Нижний предел определения патулина — 5 10~⁷ %.

Метод применяется в спорных случаях.

7.2.    Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб — по раза. 2.

7.3.    Аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения но ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 200 г. не ниже 2-го класса точности.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г, 4-го класса точности.

Спектр<м|к)тометр с диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длине волны 275 нм. с пределами допускаемой основной абсолютной по1решностн при измерении коэффициента пропускания I %; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до 5 см³/мнн, спектрофотомстрическим детектором, позволяющим проводить исследования при длине волны 275 нм. регистрирующим потенциометром (самописцем) или интегратором, колонкой длиной 250 мм и внутренним диаметром 4.6 мм. заполненной силикагелем, химически связанным с алкилнитрилом. с размером частиц 5 мкм. пред кол он кой длиной 45 мм и внутренним диаметром 4.6 мм. ‘заполненной тем же сорбентом.

Испаритель ротационный (ИР-2М или аналогичный).

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Микрошприц МШ-10 вместимостью 10 мм³.

Термометр жидкостный стеклянный но ГОСТ 2X498 с пределом допускаемой погрешности ±2 ^сС в диапазоне измерений 0—100 °С.

Стаканы по ГОСТ 25336 вместимостью 50 и 150 см³.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 100 и 250 см³.

Цилиндры по ГОСТ 1770 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 50 и 100 см³.

Воронка делительная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 250 см³.

Колба плоскодонная по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см³.

Воронка лабораторная по ГОСТ 25336 типа В диаметром 56 мм высотой 80 мм.

Колонка стеклянная хроматофафическая длиной 230 мм и внутренним диаметром 15 мм.

Колба фушевидная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом ^и/₂з вместимостью НЮ см³.

Колба остродонная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом *У23 вместимостью 25 см³.

Пипетка по ГОСТ 29227 исполнения 6 или 7 вместимостью 10 см³.

Пинетка по ГОСТ 29227 исполнения 4 или 5 вместимостью I см³.

Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ по ГОСТ 12026.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Силикагель Л. 100—160 или 100—250 мкм. фирма Лахема.

Патулин по НТД.

Бензол по ГОСТ 5956. ч. д. а., перегнанный.

Ацетонитрил по НТД. ч.. перегнанный.

Эфир этиловый уксусной кислоты по ГОСТ 22300. ч. д. а. (этилацетат), перегнанный.

Спирт изопропиловый (2-пропанол) но НТД. ч.. перегнанный.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Гексан по НТД. ч.. перегнанный.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207, х. ч.. раствор концентрацией 150 г/дм³ (раствор Карре за 1).

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч. д. а., раствор концентрацией 300 г/дм³ (раствор Карреза II).

Нафий хлористый по ГОСТ 4233. х. ч.

Натрий сернокислый безводный но ГОСТ 4166, х. ч.

Вода дистиллированная но ГОСТ 6709.

7.4. Подготовка к испытанию

7.4.1.    Приготовление стандартного раствора патулина

1 см³ первого стандартного раствора патулина. приготовленного но п. 4.2, переносят в отгонную колбу. Раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35—40 °С. Остаток в отгонной колбе растворяют в 5 см³ этилового спирта. Полученный стандартный раствор хранят в закрытом сосуде аналогично п. 4.2.

7.4.2.    Подготовка хроматограмм к работе

Готовят смесь гексана с изопропиловым спиртом (4 : 1). которую используют в качестве подвижной фазы. Устанавливают длину волны спектрофотометрического детектора на 276 нм. чувствительность детектора на 0.005 единиц оптической плотности, чувствительность самописца на 10 мВ. Подвижной <|>азой кондиционируют колонки хроматографа при скорости подачи растворителя 1.0 см³/мин. Хроматограф считается готовым к работе, если максимальный дрейф базовой линии не превышает 0.3 мВ/ч.

7.4.3.    Определение времени удерживания и градуировочного коэффициента патулина

В инжектор хроматофафа микрошприцем вводят 0.010 см³ стандартного раствор;! патулина по н. 7.4.1 и устанавливают время удерживания и высоту пика патулина на хроматограмме. Градуировочный коэффициент (А), мкг/мм. рассчитывают по формуле

где с — массовая концентрация патулина в стандартном растворе по л. 7.4.1. мкг/см³;

V — объем стандартного раствора патулина по п. 7.4.1. введенный в инжектор, см³;

И — высота инка патулина. мм.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемое относительное расхождение между которыми нс должно превышать 2 %.

Градуировку следует проводить через каждые 6 ч работы прибора.

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР, Министерством здравоохранения СССР

РАЗРАБОТЧИКИ

В. И. Рогачев, д-р техн. наук; С. Ю. Гельфанд, канд. техн. наук; Т. Н. Медведева, канд. тсхн. наук; Э. В. Дьяконова, канд. тсхн. наук; А. И. Погосян, канд. тсхн. наук; В. Л. Тутельян. д-р мсд. наук; К. И. Эллер, канд. хнм. наук; В. В. Пименова, канд. биол. наук; А. Э. Мельник; Н. И. Мушченко

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Ностановленнем Государственного комитета СССР по стандартам от 27.02.89 № 344

Изменение № 2 принято Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № II от 25.04.97)

За принятие Изменения проголосовали:

Наименоианис государства Наименование национального органа по стандартизации Азербайджанская Республика Аз госстандарт Республика Армения Армгосстанларт Республика Беларусь Госстандарт Беларуси Республика Казахстан Госстандарт Республики Казахстан Киргизская Республика Кнргиэстанларт Республика Молдова Моддовас ган, юрт Российская Федерация Госстандарт России Pec 11>бл и ка Талжи кистан Талжикгосстанларт Туркменистан Главная государственная инспекция Туркменистана

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

(Мникачение НТД. на который дана ссылка Номер раздела, пункта Обозначение НТД. на который дана ссылка Номер раздела, пункта ГОСТ 1770-74 3; 7.3 ГОСТ 6709-72 3; 7.3 ГОСТ 2603-79 3 ГОСТ 9147-80 3 ГОСТ 3118-77 3 ГОСТ 18300-87 3; 7.3 ГОСТ 4166-76 3; 7.3 ГОСТ 20015-88 3 ГОСТ 4204-77 3 ГОСТ 20490-75 3 ГОСТ 4207-75 3; 7.3 ГОСТ 22300- 76 3; 7.3 ГОСТ 4220-75 3 ГОСТ 24104-88 3; 7.3 ГОСТ 4233-77 3; 7.3 ГОСТ 25336-82 3; 7.3 ГОСТ 5556-81 3; 2 ГОСТ 26313-84 2 [ОСТ 5789-78 3 ГОСТ 26671-85 2 ГОСТ 5823-78 3; 7.3 ГОСТ 28498-90 3 ГОСТ 5848-73 3 ГОСТ 29227-91 7.3 ГОСТ 5956-78 3

5.    Ограничение срока действия снято по протоколу № 4—93 Межгосударственного совета но стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4—94)

6.    ИЗДАНИЕ (апрель 2010 г.) с Изменениями № 1, 2, утвержденными в июне 1990 г., апреле 1997 г. (ИУС 9-90, 11-97)