ГОСТ 32123-2013 Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

32123

2013

(ISO 15302:2007)

ЖИРЫ И МАСЛА ЖИВОТНЫЕ И РАСТИТЕЛЬНЫЕ

Определение содержания бенз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой

(ISO 15302:2007, MOD)

Издание официальное

Москва

Стенда ртинформ 2014

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 к Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») и Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт жиров» Российской Академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВНИИЖ Россепьхоз-академии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

дарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. № 43)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. № 224-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32123—2013 (IS0 15302:2007) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ISO 15302:2007 Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a)pyrene — Reverse-phase high performance liquid chromatography method (Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания 6енз(а)пирена. Метод с применением высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой). При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта, выделены в тексте стандарта курсивом.

Степень соответствия — модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53955—2010 (ИС0 15302:2007)

в ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодном информацион-ном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений ипопраеок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». в случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация. уведомление и тексты размещаются также е информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения национального органа Российской Федерации по стандартизации

и

Содержание

Приложение Б (справочное) Сравнение структуры международного стандарта со структурой

in

ГОСТ 32123—2013 (ISO 15302:2007)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ЖИРЫ И МАСЛА ЖИВОТНЫЕ И РАСТИТЕЛЬНЫЕ Определение содержания 6енз(а)пирена.

Метод с применением аысокоразрешающей жидкостной хроматографии с обратной фазой

Animal and vegetable fats and oils. Determination of benzo[a)pyrene.

Reverse-phase high performance liquid chromatography method

Дета ваедемия — 2014—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения бенз[а]пирена в неочищенных и рафинированных пищевых животных и растительных маслах и жирах при помощи высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обратной фазой с использованием флюориметрического определения в диапазоне от 0.1 мкг/кг до 50 мкг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие норматиеные документы:

ИСО 661:2003 Жиры и масла жиеотные и растительные. Приготовление пробы для испытания

ИСО 3696:7967 Бода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытании

ИСО 5555:2001 Жиры и масла жиеотные и растительные. Отбор проб

ГОСТ ИСО 5725-2—2003 Точность (праеильность и прецизионность) методов и результатов измерении. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 29169—91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов а информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии а сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты ». который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измеиеиным)стандартом. Если ссылочный ствндартотменен без замены, то положение, а котором дана ссылка на него, применяется а части, не затрагивающей зту ссылку.

Издание официальное

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением.

3.1 содержание бенэ[а)пирена (Ьеп2о[а)ругепе content): Массовая концентрация бенэ[а]пирена в анализируемой пробе, определенная согласно методу, установленному в настоящем стандарте.

Примечание — Содержание выражается в микрограммах на килограмм.

4 Сущность метода

Анализируемую пробу растворяют в пе тропе ином эфире и в качестве внутреннего стандарта добавляют бенэо[Ь]хризен. Соответствующее количество пробы адсорбируют в колонке с оксидом алюминия и элюируют петролейным эфиром с целью удаления всего присутствующего бенз[а]пирена.

5 Реактивы

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не указано иначе.

5.1 Вода бцдистиллированная поИСО 3696, прошедшая фильтрацию с применением мембранного фильтра с размером пор 0.45 мкм или деионизированная вода, полученная при помощи очищающих систем деминерализации воды.

5.2 Эфир петролейный (диапазон температур кипения от 40 °С до 60 °С), или гексан, повторно дистиллированный над гранулами гидроксида калия (4 г/л).

5.3 Ацетонитрил, пригодный для ВЭЖХ.

5.4 Тетрагидрофуран. пригодный для ВЭЖХ.

5.5 Смесь ацетонигрил-тетрагидрофуран. приготовленная ло 6.1.

5.6 Толуол, пригодный для ВЭЖХ.

5.7 Натрия сульфат, гранулированный, безводный.

5.8 Оксид алюминия степени активности 4. приготовленный по 6.2.

5.9 Беиз[а)пирен. чистоты 99.0 % по массе.

5.9.1 Базовый раствор бвнз[а]пирена в толуоле. 0,5 мг/см³. приготовленный по 6.3.

5.9.2 Растворы стандартные бенз(а]пирена, приготовленные по 6.4.

5.10 Раствор бвнзо(Ь)хризена в ацетонитриле внутренний стандартный, приготовленный по 6.5.

Допускается применение других реактивов по качеству не хуже вышеуказанных, в атом случае

следует провести полный холостой анализ и привести результаты этого анализа.

6 Подготовка к измерению

6.1 Приготовление смеси ацетонитрил-тетрагидрофуран

В стакане поГОСТ25336 смешивают 90 с/*³ ацетонитрила (5.3) и 10 см³ тетрагидрофура на (5.4).

6.2 Приготовление оксида алюминия степени активности 4

Реактив приготавливают из нейтрального оксида алюминия, деактивированный добавлением 10 см³ воды (5.1) к 90 г оксида алюминия (5.8).

По причине различий в активности оксида алюминия различных марок проводят проверку с целью подтверждения, что процедура деактивации подходит для полного извлечения бенз(а]пирена из эталонной пробы.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — реакция деактивации экзотермическая и возможен рост давления.

Емкость встряхивают в течение примерно 15 мин и дают содержимому прийти в уравновешенное состояние в течение 24 ч. Оксид алюминия хранят в закрытом сосуде при комнатной температуре.

6.3 Подготовка базового раствора 6енз(а]пирена в толуоле, массовой концентрации

0,5 м г/см³

Взвешивают, с точностью до 0.1 мг. около 12,5 мг бенз[а]пирена в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см³. Растворяют его в толуоле (5.6) и доводят объем раствора толуолом до метки.

Раствор хранят в темном месте при температуре 4 °С не более 6 мес.

6.4 Приготовление стандартных растворов 6енз[а]пирена

Из базового раствора бенз[а]пирена, массовой концентрации 0.5 мг/см³. готовят лва стандартных раствора с массовой концентрацией бенз[а)лирена приблизительное,2 мкг/см³ и 0,01 мкг/см³, разбавлением аликвот ацетонитрилом.

6.5 Приготовление внутреннего стандартного раствора 6ензо[Ь)хризена в ацетонитриле

Готовят базовый раствор, содержащий, с точностью до нанограмма, приблизительно 10 нг/мкл вещества. Данный раствор разбавляют в 10 раз в мерной колбе для получения внутреннего стандартного раствора с концентрацией примерно 1 нг/мкл.

Примечание — Данный раствор можно также приготовить растворением беи зо(Ь)хри зама. 99.0 % по массе, ваметонитрипе.

7 Средства измерения и оборудование

Используют обычную лабораторную аппаратуру и. в частности, следующую:

7.1 Колонку стеклянную для хроматографии, длиной 300 мм и внутренним размером диаметра 15 мм. оснащенную припаянными стеклянными дисками и краном из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

7.2 Бани водяные, любого типа обеспечивающие температуру нагрева (35 ± 2) °Си(65 12) *С.

7.3 Допускается использовать испаритель мгновенного вскипания — ротационный испаритель с созданием вакуума и бани водяной, установленной на температуру 40 °С. Необходимо принимать меры для предотвращения перекрестной контаминации. В периоды между определениями систему подвергают тщательной очистке.

7.4 Хроматограф жидкостный высокоэффективный, состоящий из насоса ВЭЖХ, инжекционного клапана с замкнутым контуром для пробы на 50 мкл, колонки с обращенной фазой, электронного интегратора и регистрирующего устройства.

Если ислользуют автодозатор, замкнутый контур для пробы между последовательными инжекциями необходимо промывать ацетонитрилом.

7.5 Колонки для анализа ВЭЖХ

7.5.1 Колонка защитная с обращенной фазой, способная отделить бенз[а]пирен от совместно экстрагируемых веществ, вместе с подходя щей предколонкой (например, предколонка из нержавеющей стали длиной 75 мм и внутренним размером диаметра 4.6 мм. заполненная Lichrosorb RP-18 (размер частиц 5 мкм).

7.5.2 Колонка с обращенной фазой для ВЭЖХ. длиной 250 мм и внутренним размером диаметра

4.6 мм (нержавеющая сталь), для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (например. Chromspher 5 РАН или Vydac 201ТР5).

7.6 Детектор флюоресценции, с длиной волны испускания 460 нм (щель 10 нм) и длиной волны возбуждения 384 нм (щель 10 нм). Детектор должен обладать требуемой производительностью для проведения анализа.

7.7 Пузырьки малого объема с суженным верхом (объемом примерно 1 мл), с прокладками со слоем ПТФЭ и алюминиевыми крышками.

7.8 Устройство ручное для обжима, и насадки крышек на пузырьки.

7.9 Пипетки одноразовые.

7.10 Колбы мерные по ГОСТ 1770. вместимостью 25 см³.

7.12 Пипетки по ГОС Г 29169. вместимостью 1 и 5 см³. снабженные безопасным устройством для отсасывания.

7.13 Микрошприцы для хроматографии, обеспечивающие полное заполнение петли инжектора.

8 Отбор проб

Отбор проб — по ИСО 5555.

В лабораторию следует поставлять представительную пробу, которая не должна подвергаться порче или изменению во время транспортирования или хранения.

9 Подготовка пробы для определения

Подготовка проб — по ИСО 661.

10 Проведение определения

10.1 Проба для анализа и приготовление испытуемого раствора

10.1.1 Взвешивают, с точностью до 0.001 г. около 0,400г пробы продукта в стеклянном лабораторном стакане поГОСТ25336и растеоряют в 2 см³ летролейногоэфира (5 2). Добавляют20мкл вмутреннего стандартного раствора (5.10) при помощи микрошприца. Это эквивалентно 50 мкг/кг при пересчете на массу пробы. Если ожидается высокий уровень бенэ(а]пирека. добавляют 50 мкл внутреннего стандартного раствора (5.10). Это эквивалентно 125 мкг/кг лри пересчете на массу пробы.

10.1.2 Хроматографическую колонку (7.1) заполняют на половину ее высоты петролейным эфиром (5.2). Незамедлительно взвешивают 22 г оксида алюминия (5.8) в химическом стакане по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см³ и тут же переносят в колонку, после чего осторожно встряхивают колонку для усиления эффекта седиментации оксида алюминия.

10.1.3 Добавляют безводный сульфат натрия (5.7) к верхней части колонки для образования слоя толщиной 30 мм.

10.1.4 Открывают кран и дают летролейному эфиру стечь до уровня верха слоя сульфата натрия.

10.1.5 Под колонкой помещают мерную колбу на 20 см³.

10.1.6 Вводят раствор масла (10.1.1) в колонку. Промывают колонку минимальным количеством петролейного эфира (5.2), давая слою растворителя пройти сквозь слой сульфата натрия в период между промывками.

10.1.7 Элюируют колонку с использованием петролейного эфира со скоростью потока приблизительно 1 мл/мин. удаляя первые 20 см³ элюата и собирая последующие 60 см³ элюата в круглодонную колбу объемом 100 см³.

10.1.8 Выпаривают растворитель из элюата на водяной бане, установленной на 65 °С, до объема приблизительно от 0.5 см³ до 1,0 см³, и переносят концентрированный раствор в пузырек малого объема с суженым верхом (7.7). предварительно взвешенный с точностью 0,1 мг.

10.1.9 Продолжают выпаривание из пузырька на водяной бане (5.1). установленной на температуру 35 *С в слабом токе азота (около 25 сл#³/мин) до практически сухого состояния. Споласкивают круглодонную колбу 1 мл петролейного эфира и количественно переносят промывочный раствор в пузырек, продолжая выпаривание в атмосфере азота. Процедуру ополаскивания повторяют со свежей порцией петролейного зфира, и количественно переносят промывочный раствор в пузырек.

Примечание — в пункте 10.1.9 приводится уточнение процедуры выпаривания е цепях более точного сбора элюата.

10.1.10 Продолжают выпаривание при температуре 35 ^еС в токе азота до сухого остатка.

10.1.11 Пузырек взвешивают с точностью до 0.1 мг и рассчитывают массу остатка. Укупоривают пузырек прокладкой из ПТФЭ и алюминиевой крышкой и хранят при температуре 4 °С.

10.2 Высокорларешающая жидкостная хроматография

10.2.1 Используют смесь из 880 см³ ацетонитрила (5.3) и 120 см³ воды (5.1) в качестве растворителя для элюирования. Дегазируют растворитель для элюирования с целью устранения кислорода во избежание гашения флюоресценции. Используют продувку гелием или подключенную установку вакуумной дегазации.

10.2.2 Элюируют со скоростью потока около 1 мл/мин.

10.2.3 Калибровочная кривая и определение относительного коэффициента чувствительности детектора

Готовят 5 разбавлений стандартного раствора бенз(а]пирена (5.9.2) таких, чтобы инжекция 50 мкл каждого из них давала результаты, соответствующие 0,01 иг, 0.04 нг. 0.2 нг, 1.0 нг и 2.0 нг бенз|а]пирена. К стандартным растворам добавляют 0.5 нг внутреннего стандарта. На основе данных растворов строят калибровочную кривую из пяти точек, используя площади пиков, полученные интегратором и регистрирующим устройством. Данную калибровку также используют для расчета относительного коэффициента чувствительности детектора (10.1), между бенэ!а]пиреном и внутренним стандартным раствором.

10.3 Анализ проб

10.3.1 Инжектируют 250 мкл смеси ацетонитрил-тетрагидрофуран (5.5) в пузырек, содержащий очищенный остаток (10.1.11). Растворяют остаток путем осторожных круговых движений, избегая контакта растворителя с прокладкой.

Используя калибровочную кривую (10.2.3), определяют уровни бенз[а]пирена от 0.1 мкг/кг до 50 мкг/кг.

8 случае концентраций больше 10 мкг/кг раствор остатка (10.3.2) разбавляют далее смесью ацето-нитрил-тетра гидрофура и (5.5). или инжектируют меньший объем, чем 50 мкл (10.3.2).

10.3.2 Инжектируют точно известный объем, примерно 50 мкл растворенного остатка в колонку для ВЭЖХ и начинают процесс хроматографии.

Необходимо принять меры, чтобы гарантировать введение не более 1,5 мг остатка в колонку. Если присутствует большее количество остатка, необходимо отрегулировать количество тетрагидрофурана (5.4) или повторить стадию очистки.

11 Обработка результатов

11.1 Расчет относительных коэффициентов чувствительности

На основе полученных данных (10.2.3) рассчитывают относительный коэффициент чувствительности. f_tt в качестве среднего арифметического значения пяти стандартных растворов с использованием уравнения:

f — (1)

где — площадь лика внутреннего стандартного раствора:

Рвлр ““ концентрация бенз[а]лирена. микрограмм на литр:

А&>р — площадь лика бенэ(а]пирена:

— концентрация внутреннего стандартного раствора, микрограмм на литр.

11.2 Расчет содержания 6еиз[а]пиреиа

Содержание бенз[а]лирена, W_B4tf* мкг/кг. в анализируемой пробе рассчитывают с использованием уравнения:

^ = (2)

4. m

где т — масса анализируемой пробы, г;

f_a — средний коэффициент чувствительности, рассчитанный на основе стандартных растворов (11.1);

Содержание бенэ(а]пирена выражается в качестве фракции массы в микрограммах на килограмм с точностью до одного десятичного знака для содержания от 0 мкг/кг до 10 мкг/кг и до ближайшего целого числа для содержания, превышающего 10 мкг/кг.

12 Точность

12.1 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному испытуемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5 % случаев превышать предел сходимости, г. приведенный в приложении А (таблица А.1).

12.2 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученным и с использованием одного и того же метода применительно к идентичному испытуемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5 % случаев превышать предел воспроизводимости, R приведенный в приложении А (таблица А. 1).

Результаты межлабораторных испытаний

В 16 лабораториях иа 7 стран были осуществлены международные совместные ислытания трех образцов с различным содержанием бенз(а)лирена (низким, средним и высоким). Результаты пяти лабораторий не были приняты во внимание, так как они были основаны не на протоколе метода, а на собственных внутренних методах.

Испытания были организованы а 2006 г. комитетом-членом (Голландия), полученные результаты прошли статистический анализе соответствии с ГОСТ ИСО 572S-2C целью получения данных относительно точности, приведенных в таблице А.1.

Таблица А.1— Результаты мехлабора торных испытаний

Сравнение структуры международного стандарта со структурой межгосударственного стандарта

Таблица 8.1

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов международным стандартам, использованным в качестве ссылочных в примененном международном стандарте

Таблице ДА.1

УДК 636.087.07:006.354 МКС 67.200.10 Н59

Ключевые слова: жиры и масла животные и растительные, содержание бенз[а]пирена. термины и определения. сущность метода, реактивы, подготовка к определению, средства измерения и оборудование, проба для анализа, проведение определения, высокоэффективная жидкостная хроматография, обработка результатов

Редактор U.H. Максимов*

Технический редактор В.Н. Прусакове Корректор МВ. бучноя Компьютерная верстка И.А. Напейкиноо

Сдано а набор 06.12 2013. Подписано о печать 27.12 2013. Формат 60-64 Гарнитура Аркал. Уел. печ. л. 1.40. Уч.-иад. л. 1.00. Тираж 113 эм. Зак. 1S27.

. 12399S Москва. Гранатный пер.. 4.

Набрано ао ФГУП «СТАНДАРТИИФОРМ» на ПЭвМ.

Отпечатано е фипиапе —« тип * Московским печатник». 105062 Москва. Ляпин пер.. 6.