ГОСТ Р 51196-98 Молоко сухое. Метод определения молочной кислоты и лактатов

>

ГОСТ Р 51196-98 (ИСО 8069—86)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО СУХОЕ

Метод определения молочной кислоты и лактатов

Издание официальное

Москва

Стэндартинформ

2009

Предисловие

• 1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией нишевых производств

ВНЕСЕН Техническим комитетом ио стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

• 2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. № 334

• 3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 8069—86 «Сухое молоко. Определение содержания маточной кислоты и лактатов. Ферментативный метод» с допатнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2. 3 и 7.1)

• 4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

• 5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 2009 г.

© ИПК Издательство стандартов. 1998 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2009

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 51196-98 (ИСО 8069-86)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО СУХОЕ

Метод определения молочной кислоты и лактатов

Dried milk. Method for determination of lactic acid and lactates

Дата введения 2000—01—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сухое молоко всех видов и устанавливает метод определения молочной кислоты и ее солей — лактатов.

2 Нормативные ссылки

ГОСТ 26809—86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу

3 Определение

Массовая доля маточной кислоты и лактатов в сухом маюке. определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в 1раммах маточной кислоты на 100 г сухого обезжиренною вещества.

4 Сущность метода

Восстанавливают пробу сухого молока в теплой воде, осаждают жиры и белки и фильтруют пробу. Полученный фильтрат обрабатывают ферментами и биохимическими реагентами, добавляемыми одновременно, но действующими последовательно:

• — L-лактатдегидрогеназа (L-ЛДГ) и О-лактатдешдрогеназа (D-ЛДГ) в присутствии никотина-мидадениндинуклеотила (НАД) окисляют лактат до пирувата, восстанавливая НАД до НАДН:

D-ЛДГ

L-ЛДГ

Ь-лактат/О-лактат+НАД* — НАДН+пируват+Н*;

• — глутаматпируваттрансфераза (ГПТ) в присутствии L-глутамата преобразует пируват в L-ала-нин и L-глутамат в альфа-кетоглутарат:

ГПТ

пируват+ L-глутамат——-> L-a.iaHHH+2-оксоглутарат.

Измеряют массовую долю образовавшегося НАДН. эквивалентную массовой доле молочной кислоты и лактатов в пробе, на спектрофотометре при длине волны 340 нм.

5 Реактивы

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Вода, испатьзуемая для приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной. Вода для приготовления растворов других реактивов и проб должна быть дистиллированной.

Препарат НАД до^гжен содержать не менее 90 % основного вещества.

Издание официальное

• 5.1 Раствор гексацианоферрата (II) калия

Растворяют 35.9 г гексацианоферрата (II) калия K₄[Fe(CN₆)] х ЗН₂О в воде и доводят объем раствора до 1 дм³. Раствор перемешивают.

• 5.2 Раствор сульфата цинка

Растворяют 71.8 г сульфата цинка гептагидрата (ZnSO₄-7H₂O) в воде и доводят объем раствора до 1 дм³. Раствор перемешивают.

• 5.3 Раствор гидроксида натрия с (NaOH) = 0.1 моль/дм³

Растворяют 4.00 г гидроксида натрия (NaOH) в воде и доводят объем раствора до 1 дм³. Раствор перемешивают.

• 5.4 Буферный раствор активной кислотности 10.0 pH

Растворяют 7,92 г глицилглицина (C₄H_SN₂O₃) и 1.47 г L-глутаминовой кислоты (C₅H₉NO₄) в 80 см³ воды. Устанавливают активную кислотность раствора (10.0=0,1) pH при 20 ’С раствором гидроксида натрия с (NaOH) = 10 моль/дм³ и доводят объем раствора водой до 100 см³. Раствор перемешивают.

Раствор устойчив 3 мес при температуре от 0 до 5 ’С.

• 5.5 Раствор НАД

Растворяют 350 мг НАД (C₂₂H₂₇N-O₁₄P₂) в 10 см³ воды.

Раствор устойчив 1 мес при температуре от 0 до 5 ’С.

Во время использования сосуд с раствором даокен быть погружен в емкость с колотым льдом.

• 5.6 Раствор L-ЛДГ

Растворяют 10 мг L-ЛДГ из мускульных тканей свиньи в 1 см³ раствора глицерина массовой доли 50 % (активная кислотность приблизительно 7 pH).

Удельная активность раствора L-ЛДГ должна быть не менее 5500 Е/см³ при 25 ’С. Раствор устойчив 12 мес при температуре от 0 до 5 *С.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

• 5.7 Суспензия D-ЛДГ

Смешивают 5 мг D-ЛДГ из Lactobacillus leichmannii с 1 см³ раствора сульфата аммония c((NH₄),SO₄) = 3.2 моль/дм³ (активная кислотность приблизительно 6 pH).

Удельная активность суспензии D-ЛДГ должна быть не менее 1500 Е/см³ при 25 *С. Суспензия устойчива 12 мес при температуре от 0 до 5 ’С. Во время использования сосуд с суспензией должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

• 5.8 Суспензия ГПТ

Суспензию ГПТ из сердца свиньи концентрации 20 мг/см³ удельной активности 1600 Е/см³ при 25 ^вС в растворе сульфата аммония с ((NH₄)₂SO₄) = 3.2 моль/дм³ готовят центрифугированием 2 см³ суспензии концентрации 10 мг/см³ в течение 10 мин (при факторе разделения ценгрифуги 4000 g). Отбирают 1 см³ надосадочной жидкости и отбрасывают, а оставшуюся суспензию используют для анализа.

Готовая суспензия устойчива при температуре от 0 до 5 ^вС 12 мес. На время работы сосуд с суспензией помещают в емкость со льдом.

• 5.9 Раствор L-л актата лития

Растворяют 50 мг L-лактата лития (C₃H₅O₃Li) в воде и доводят объем раствора до 500 см³. Раствор перемешивают.

• 5.10 Раствор D-л актата лития

Растворяют 50 мг D-лактата лития (C₃H₅O₃Li) в воде и доводят объем раствора до 500 см³. Раствор перемешивают.

6 Средства контроля и вспомогательные устройства

Обычная лабораторная аппаратура, в том числе указанная в 6.1—6.11.

• 6.1 Весы лабораторные общего назначения наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью -0.001 г.

• 6.2 Стаканчик стеклянный для взвешивания или бюкса вместимостью 50 см³.

• 6.3 Цилиндр градуированный вместимостью 50 см³ и допускаемой относительной погрешностью =2 %.

• 6.4 Колбы мерные вместимостью 100 см³ и допускаемой относительной погрешностью =0.2 %.

• 6.5 Дозаторы пипеточные объемами доз 0,02; 0.05; 0.2; 1 и 2 см³ и относительной погрешностью дозирования -1 %.

• 6.6 Пипетки градуированные вместимостью 2, 5 и 10 см³ и допускаемой относительной погрешностью =1 %.

• 6.7 Воронка стеклянная для фильтрования диаметром 7 см.

• 6.8 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см, свободные от молочной кислоты и лактатов.

• 6.9 Палочка стеклянная.

• 6.10 Палочки пластиковые или иные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

• 6.11 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: длина волны 340 нм; спектральный интервал — не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности — от 0.000 до 2.000; погрешность установки длины волны — ±3 нм: среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0.15 %.

Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 1 см.

7 Порядок подготовки к проведению измерений

• 7.1 Отбор проб — по ГОСТ 26809.

• 7.2 Пробу хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

8 Порядок проведения измерений

При проведении измерений следует избегать загрязнений, в том числе связанных с поглощением влаги или конденсацией ее на стенках сосудов.

• 8.1 Проверка активности реактивов

При приготовлении новой порции реактивов (5.5—5.8) и хранении готовых реактивов без использования более двух недель или изменении условий хранения проверяют активность реактивов.

• 8.1.1 Для проверки активности реактивов в две мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см’ вносят по 10 см³ L-лактата лития (5.9). в две другие мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см³ вносят по 10 см³ D-лактата лития (5.10). Определяют концентрации L-.молочной кислоты и ее лактатов, а также концентрацию D-маточной кислоты и ее лактатов (8.5.2—8.6).

• 8.1.2 Концентрации D-лактата лития. Хп._(ШПП. и L-лактата лития. мг/дм³. вычисля

ют по формулам:

лактата = 346 х Д А;

А| ли-птп 341 X Д А,

где д А — разность оптических плотностей, рассчитанная по 8.6.4.

• 8.1.3 Принимая во внимание чистоту реактивов, определенная концентрация лактата лития при проверке активности реактивов должна составлять (100±5) % концентрации приготовленных растворов.

Если определяемое значение не попадает в этот интервал, проверяют реактивы, технику измерения, точность пипеток и дозаторов, а также исправность спектрофотометра. После этого тестирование повторяют до получения удовлетворительных результатов.

• 8.2 Подготовка пробы

Пробу продукта помешают в контейнер вместимостью, в два раза превышающей объем пробы, с герметично закрывающейся крышкой, тщательно перемешивают, энергично встряхивая и переворачивая контейнер.

В процессе подготовки пробы необходимо исключить ее контакт с атмосферой, чтобы уменьшить абсорбцию влаги.

• 8.3 Масса навески

В стеклянном стаканчике (6.2) взвешивают 1.000 г пробы.

• 8.4 Подготовка контрольной пробы

Контрольное испытание проводят, как описано в 8.5—8.6. используя те же реактивы, но без пробы продукта. Для испытания пробы продукта (8.6) берут 1.0 см³ фильтрата (8.5.3).

• 8.5 Приготовление раствора пробы и удаление белка

  • 8.5.1 Навеску сухого молока (8.3) растворяют при помешивании стеклянной палочкой (6.9) в 20 см³ воды температурой от 40 до 50 ’С. количественно переносят в мерную колбу (6.4) вместимостью 100 см³ и охлаждают до комнатной температуры (20 *С).

  • 8.5.2 К раствору в колбе (8.5.1) последовательно добавляют 5.0 см³ раствора гексацианоферрата (II) калия (5.1). 5.0 см³ раствора сульфата цинка (5.2). 10 см³ раствора гидроксида натрия (5.3). тщательно перемешивая содержимое колбы после добавления каждого компонента и доводят объем раствора водой до 100 см³. Снова тщательно перемешивают раствор и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.

  • 8.5.3 Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр (6.8). отбрасывая первую порцию фильтрата.

• 8.6 Определение

  • 8.6.1 В спектрофотометрическую кювету (6.11) пипеточным дозатором (6.5) вносят:

• — 1.0 см³ фильтрата (8.5.3):

• — 1.0 см³ буферного раствора (5.4);

• — 0.20 см³ раствора НАД (5.5);

• — 0.02 см³ суспензии ГПТ (5.8).

Содержимое кюветы перемешивают палочкой (6.10).

• 8.6.2 Кювету выдерживают 5 мин, затем измеряют оптическую плотность раствора относительно воды при длине волны 340 нм.

В кювету добавляют 0,02 см³ раствора L-ЛДГ (5.6) и 0.05 см³ раствора D-ЛДГ (5.7). Раствор перемешивают палочкой (6.10).

Примечание — Раздельное определение L- и D-маточных кислот и их лактатов в пробе можно осуществить добавлением или L-ЛДГ ши D-ЛДГ.

• 8.6.3 Раствор (8.6.2) выдерживают при комнатной температуре 45 мин и измеряют оптическую плотность. Раствор выдерживают еще 15 мин и снова измеряют оптическую плотность (измерения после 60 мин реакции).

Примечание — Если требуется определить содержание только L-молочной кислоты и ее лактатов. измерения производят соответственно через 30 и 45 мин.

• 8.6.4 Рассчитывают разность измеренных значений оптических плотностей по формуле

д А [(Л _Пбо—А но)—4(А _пбо—А _П4?)]—1(4 кбо—4 ко)—4(Л кбо—4 к4э)1′

где А _п60 — оптическая плотность пробы через 60 мин (8.6.3);

A _Iri) — оптическая плотность пробы через 5 мин (8.6.2);

4_п45 — оптическая плотность пробы через 45 мин (8.6.3);

Л _к60 — оптическая плотность контрольной пробы через 60 мин (8.6.3): 4*0 — оптическая плотность контрольной пробы через 5 мин (8.6.2);

4 _к45 — оптическая плотность контрольной пробы через 45 мин (8.6.3).

Примечания

• 1 В некоторых случаях может иметь место медленно текущая побочная реакция. Изменение оптической плотности. вызванное этой реакцией, исключают экстраполяцией оптической плотности на нулевой момент времени.

• 2 Если О1гпг!сскую плотность измеряют через 30 и 45 мин. формула имеет вил

А А 1(4 _С45 A _nq) 3(4 п45 4_njo)J [(4 _к45 4_ко) 3(4 _к4$ А кзо)|.

где А „30 — оптическая плотность пробы через 30 мин (8.6.3);

А _кзо — оптическая плотность контрольной пробы через 30 мин (8.6.3).

• 8.6.5 Если разность оптических плотностей, рассчитанная в соответствии с 8.6.4. превышает 0.500, определение повторяют (8.6.1—8.6.4). разводя дистиллированной водой растворы пробы продукта (8.5.3) и контрольной пробы (8.4).

9 Правила обработки результатов измерений

• 9.1 Метод расчета

Массовую долю молочной кислоты и лактатов X в сухом молоке, выраженную в г маточной кислоты на 100 г сухого обезжиренного вещества, вычисляют по формуле

_{х =} ьАхМ И, хГ₄ хИ₅ 100 _{х 10}2.

Е х 1 х т У₂ * ^3 ^оса

где А — разность оптических плотностей (8.6.4);

М — молярная масса молочной кислоты. М = 90.1 г/мать;

• — объем раствора в кювете (8.6.2). см³

(для определения D- и L-молочных кислот = 2.29 см³, для определения L-молочной кислоты И, = 2.24 см³, для определения U-молочной кислоты = 2.27 см³);

К₄ — объем подготовленного к анализу раствора (8.5.2). см³ (И₄ = 100 см³);

И₅ — объем разведенного фильтрата (8.6.5). см³ (если испытание проводилось без разведения фильтрата, то = 1.0 см³);

с — коэффициент оптической плотности НАДН. дм³ммоль^_,см^_1. равный:

при длине волны 340 нм — 6.3.

при длине волны 365 нм — 3.5. при длине волны 334 нм — 6.18;

/ — толщина поглощающего слоя в кювете, см;

т — масса навески сухого молока, г (8.3);

V₂ — объем фильтрата (8.5.3) в спектрофотометрической кювете (8.6.4). см³:

• — объем фильтрата (8.5.3). взятый для разведения (8.6.5). см³ (если испытание проводилось без разведения фильтрата, то И₃ = 1 см³);

• — массовая доля сухого обезжиренного вещества в пробе продукта. %.

Результат определяют с точностью 0.001 % (г/100 г).

• 9.2 Точность

Примечание — Сходимость и воспроизводимость были рассчитаны но результатам межлабораторных испытаний.

• 9.2.1 Сходимость

Абсатютное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать г= 0.010 г/100 г. если среднее арифметическое результатов не превышает 0.060 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выпаженных в одной лаборатории, не должно превышать 15 % среднего арифметического значения, если оно превышает 0.060 г/100 г.

• 9.2.2 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не жыжно превышать R = 0.015 г/100 г. если среднее арифметическое результатов не превышает 0.100 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать 20 % среднего арифметического значения, если оно превышает 0.100 г/100 г.

10 Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны:

• — используемый метод;

• — полученные результаты;

• — любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

УДК 637.143.001.4:006.354 ОКС 67.100.10 Н19 ОКСТУ 9209

Ключевые слова: сельскохозяйственные продукты, молочные продукты, молоко, сухое молоко, химический анализ, определение массовой доли, молочная кислота, лактаты

6