ГОСТ Р 56962-2016 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Метод определения остаточного содержания трифенилметановых красителей с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором высокого разрешения

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО

ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР

56962-

2016

РЫБА, НЕРЫБНЫЕ ОБЪЕКТЫ И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НИХ

Метод определения остаточного содержания трифенилметановых красителей с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором высокого

разрешения

Издание официальное

Москва

Стенда ртмнформ 2016

ГОСТ Р 56962—2016

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 300 «Рыбные продукты пищевые, кормовые. технические и упаковка»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 июня 2016 г. № 621-ст

4 8ВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОС Г1.0—2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по соспюянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты». а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет ()

© Стандартинформ.2016

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 56962—2016

Содержание

1 Область применения……………………………………………1

2 Нормативные ссылки…………………………………………..1

3 Сущность метода……………………………………………..2

4 Требования безопасности и условия выполнения измерений…………………….2

5 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы………………….2

6 Подготовка к проведению измерений………………………………….4

6.1 Подготовка лабораторной посуды и реактивов………………………….4

6.2 Приготовление растворов……………………………………..4

6.3 Приготовление градуировочных растворов……………………………5

7 Отбор и подготовка проб…………………………………………7

7.1 Отбор проб………………………………………………7

7.2 Подготовка проб…………………………………………..7

8 Порядок выполнения анализа………………………………………8

8.1 Условия хроматографических измерений……………………………..8

8.2 Построение градуировочной характеристики…………………………..10

8.3 СбЭЖХ*ВПМС/МС измерение…………………………………..10

9 Обработка результатов измерений…………………………………..11

10 Метрологические характеристики…………………………………..11

11 Оформление результатов измерений………………………………..12

12 Контроль стабильности результатов измерений…………………………..12

in

ГОСТ Р 56962—2016

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РЫБА, НЕРЫБНЫЕ ОБЪЕКТЫ И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НИХ

Метод определения остаточного содержания трифенилметановых красителей с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором высокого разрешения

Fish, поп-flsh objects end products from them. Method for determination of residual content of tnphenylmelhene dyes using ultra performance liquid chromatography with quadrupoie-time-of-flight mass spectrometry

Дата введения — 2017—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на рыбу, нерыбные объекты (ракообразные, моллюски) и продукцию из них и устанавливает метод сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором высокого разрешения (далее — СВЭЖХ-ВПМС/МС) для определения остаточного содержания трифенилметановых красителей в диапазоне измерений от 0,5 до 6.0 мкг/кг.

2 Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ OIML R 76—1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 2603—79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 3652—69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия ГОСТ 4172—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двуэамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 5848—73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 6995—77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 10873—73 Аммоний сернокислый (сульфат аммония) очищенный. Технические условия ГОСТ 22300—76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 31339—2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

Издание официальное

1

ГОСТ Р 56962—2016

Применение — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта сучетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта а ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применятьбез учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение. в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Количественное определение остаточного содержания трифенилметановых красителей (анали-тов) измеряют методом внутреннего стандарта по площадям пиков идентифицированных соединений с помощью градуировочной характеристики сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии сере* мяпролетным масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения в режиме мониторинга выбранных реакций (MRM).

4 Требования безопасности и условия выполнения измерений

4.1 Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1*го и 2-го класса опасности по ГОСТ 12.1.007. при работес ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работе токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

4.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны бытьоборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3 Приготовление градуировочных растворов проводят в вытяжном шкафу.

4.4 К выполнению измерений методом СВЭЖХ-ВПМС/МС допускаются лица, владеющие техникой СВЭЖХ-ВПМС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемой аппаратуры

4.5 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

— температура окружающего воздуха……………………….от20 ‘СдоЗО *С;

— атмосферное давление………………………………от84до106кЛа;

— напряжение в питающей электросети………………………от 200 до 240 В;

• частота переменного тока………………………………от 49 до 51 Гц;

• относительная влажность воздуха………………………..от40%до80%.

5 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы

5.1 Для определения остаточного содержания трифенилметановых красителей применяют следующие средства измерений, аппаратуру, материалы и посуду:

• весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой погрешности ±0.001 г;

• весы микроаналитические с наибольшим пределом взвешивания 80 г. с пределом абсолютной допускаемой погрешности не более ±0,01 мг;

— масс-спектрометр с времяпропетным детектором высокого разрешения и диапазоном измерений от 50 до 3000 атомных единиц массы (а. е. м.). массовым разрешением не менее 3000 а. е. м.. точностью измерения массы не менее 0.5 а. е. м., с режимом получения фрагментных ионов (режим МС/МС);

— баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм³;

— встряхиватель (шейкер) еортексного типа с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин:

— встряхиватель (шейкер) переворачивающий орбитального типа с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;

• измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

— камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 20 *С до минус 40 *С;

2

ГОСТ Р 56962—2016

• колонку хроматографическую длиной 50 мм и диаметром 1 мм с гибридным обращеннофазным сорбентом, диаметром частиц сорбента не более 1.7 мкм;

• компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

• систему сверхвысокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем, термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до (30 ± 1) *С;

• систему получения деионизованной воды высокой чистоты;

• систему упаривания растворителей, обеспечивающую поддержание температуры не менее 50 *С;

• устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

• холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 *С до 5 °С;

• центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 4750 об/мин и диапазоном температур от 4 ‘С до 25 °С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см³ и микроцен-трифужных пробирок вместимостью 1.5 см³;

• шкаф сушильный лабораторный с рабочим диапазоном температур от 50 *С до 200 ^вС;

• картриджи для твердофазной экстракции вместимостью не менее Зсм³. заполненные 60 мг сбалансированного гидрофильно-липофильного обращеннофазного сорбента с размером частиц от 30 до 60 мкм;

• пробы, не содержащие трифенилметановых красителей, подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 7 и 8. («чистые» пробы)¹¹;

• фильтры нейлоновые мембранные с размером диаметра пор не более 0.2 мкм;

• еиалы (флаконы) для автоматического устройства ввода проб вместимостью 2 см³ с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками 9 мм;

— колбы 1-10(50.500.1000.2000)-1 лоГОСТ 1770;

• колбы конические Кн—1—500—29/32 ТС по ГОСТ 25336;

• пипетки одноканальные переменкой вместимости 5—25 мм³. 20—100 мм³. 200—1000 мм³ . 500—5000 мм³ с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ±1 %;

• пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см³.50 см³ с завинчивающимися крышками;

• шприцы одноразовые вместимостью 2 см³;

• цилиндры 1-25(50,100,250.500.1000)-1 лоГОСТ 1770.

5.2 При определении остаточного содержания трифенилметановых красителей применяют следующие реактивы:

• аммония сульфат по ГОСТ 10873;

• ацетон по ГОСТ 2603;

• ацетонитрил для 8ЭЖХ-МС с массовой долей основного вещества не менее 99.9 %;

• 2.3-дихлоро-5.6-дициано-пара-бенэохинон (ДЦБ) с массовой долей основного вещества не менее 99 %;

• дихлорметан с массовой долей основного вещества не менее 99 %;

• кислоту лимонную по ГОСТ 3652;

• кислоту муравьиную по ГОСТ 5648. ч.д.а.;

— метанол по ГОСТ 6995. х.ч.;

• натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 4172;

• н-гексан.х. ч.;

• хлоранил с массовой долей основного вещества не менее 99 %:

• этилацвтат по ГОСТ 22300. ч.д.а.:

• воду деионизованную для ВЭЖХ, полученную с использованием системы производства ультра-чистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709.

5.3 При определении остаточного содержания трифенилметановых красителей в качестве образцов сравнения применяют следующие соединения:

1) Для приготовления исходных растворов с массовой долей основного вещества:

• малахитовый зеленый — не менее 98%;

• кристаллический фиолетовый — не менее 90 %;

• бриллиантовый зеленый —не менее 90%.

Срок хранения «чистых» проб при температуре от минус 20 *С до минус 40 *С — не более трех мес.

3

ГОСТ Р 56962—2016

2} Для приготовления исходных растворов внутренних стандартов с массовой долей основного вещества:

• малахитовый зеленый-05 — не менее 95 %;

— кристаллический фиолетовый-06 — не менее 95 %.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1 Подготовка лабораторной посуды и реактивов

6.1.1 Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов используют отдельные сушильные шкафы. Не допусхается проведение подготовки посуды в данном помещении для других видов анализов.

6.1.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно). ацетоном (дваеды).

6.1.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 *Сдо110 *С.

6.1.4 Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения анализа холостой пробы.

6.2 Приготовление растворов

6.2.1 Приготовление подвижных фаз А и Б

6.2.1.1 Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 999 см³ деионизованной воды, добавляют 1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.2.1.2 Для приготовления подвижной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 500 см³ ацетонитрила. 500 см³ метанола, добавляют 1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 6 мес.

6.2.2 Приготовление раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 0,1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 19.212 г лимонной кислоты, доливают порциями

деионизованную воду, тщательно перемешивают и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 недели.

6.2.3 Приготовление раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного с молярной концентрацией 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 2000 см³ вносят 56.796 г натрия фосфорнокислого двузамещенного. доливают порциями деионизованную воду, тщательно перемешивают и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 недели.

6.2.4 Приготовление буферного раствора

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 891 см³ раствора лимонной кислоты (см. 6.2.2) и 109 см³ раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного (см. 6.2.3), перемешивают.

Используют свежеприготовленный раствор.

6.2.5 Приготовление раствора для экстракции

В колбу вместимостью 500 см³ вносят 250см³ буферного раствора (см. 6.2.4) и 250см³ ацетонитрила. перемешивают.

Используют свежеприготовленный раствор.

6.2.6 Приготовление раствора хлоранила с молярной концентрацией 0,001 моль/дм³

В мерной колбе вместимостью 50 см³ взвешивают 12.2 мг хлоранила. наливают ацетонитрил до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 недели.

6.2.7 Приготовление раствора ДДБ с молярной концентрацией 0,001 моль/дм³

В мерной колбе вместимостью 50 см³ взвешивают 11.35 мг ДДБ. наливают ацетонитрил до метки и перемешивают.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 недели.

ГОСТ Р 56962—2016

6.2.8 Приготовление вспомогательных растворов (ВР)

6.2.8.1 Приготовление ВР муравьиной кислоты в деионизованной воде в объемном соотношении 1:19 (ВР1)

В полипропиленовую пробирку вместимостью 50см³ вносят 2.5 см³ муравьиной кислоты и 47,5 см³ деионизованной воды, перемешивают.

6.2.8.2 Приготовление ВР метанола, муравьиной кислоты в деионизованной воде в объемном соотношении 1:1:18{ВР2)

8 полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ вносят 2.5 см³ метанола. 2.5 см³ муравьиной кислоты и 45 см³ деионизованной воды, перемешивают.

6.2.8.3 Приготовление ВР метанола, муравьиной кислоты в деионизованной воде в объемном соотношении 10:1:9 (ВРЗ)

8 полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ вносят 25 см³ метанола. 2.5 см³ муравьиной кислоты и 22.5см³ деионизованной воды, перемешивают.

6.2.8.4 Приготовление ВР этилацетата с гексаном в объемном соотношении 1:1 (8Р4)

6 полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ вносят 25 см³ этилацетата и 25 см³ гексана, перемешивают.

6.2.8.5 Приготовление ВР этилацетата. метанола и муравьиной кислоты в объемном соотношении 500:500:1 (ВР5)

8 полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ вносят 25см³ этилацетата. 25см³ метанола и 0,05см³ муравьиной кислоты, перемешивают.

6.2.6.6 Приготовление ВР метанола, деионизованной воды и муравьиной кислоты в соотношении 400:599:1 (ВР6)

8 полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ вносят 20см³ метанола. 30 см³ деионизованной воды и 0.05 см³ муравьиной кислоты, перемешивают.

Срок хранения вспомогательных растворов при комнатной температуре — не более 1 недели.

6.3 Приготовление градуировочных растворов

6.3.1 Приготовление исходных растворов С₀ трифенилметановых красителей Для приготовления исходных растворов (С₀) концентрацией 500 мкг/см³ рассчитывают навеску, эквивалентную 5.0 мг малахитового зеленого, кристаллического фиолетового, бриллиантового зеленого, исходя из массовой доли в исходном веществе по формуле (1). после чего переносят каждое вещество по отдельности в мерные колбы вместимостью 10 см³. Доводят до метки метанолом, перемешивают и помешают е ультразвуковую баню на 1 мин.

т-щ

100%

м~с

О)

гдет₀ — масса основного вещества, г (т₀ — Юг);

— молярная масса соли анализируемого соединения (для анализируемых соединений, растворы которых готовят из солей), г/моль;

М — молярная масса анализируемого соединения, г/моль:

с — массовая доля анализируемого соединения (илиегосоли) в исходном веществе. %. СрокхраненияраствороепритемпературеотминусЗО *Сдоминус40 *С — не более одного года. Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.2 Приготовление рабочих растворов С,, С₂

Рабочие растворы С,. С₂ готовят е мерных колбах вместимостью 10 см³ согласно рисунку 1.

ГЕСом* риствср С) о насос шЛ мицмгтрецшй —дпго wwMm&ieftM*	Atitoert раствор Cg о мяоаовой жмутршуй «вждаго отлита 0,06 mrtw3
Берут по 0,1 ша мвдо!о росту С*	Берут пс 0,1 ом3 иоадого расту С<

Домоягдв мглы метают, тремшееают Помещает в рътраяушау» бане на 1 инн

Рисунок 1 — Приготовление рабочих растворов С,. С₂

S

ГОСТ Р 56962—2016

Растворы С,, С₂ хранят при температуре от минус 30 °С до минус 40 *С. Срок хранения раствора С, — не более одного года. С₂ — не более 6 мес.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.3 Приготовление исходных растворов внутренних стандартов

Для приготовления исходных растворов внутренних стандартов О₀ концентрацией 500 мкг/см³ взвешивают по 5.0 мг малахитового зеленого*05. кристаллического фиолетового-Об и переносят каждое вещество по отдельности в мерные колбы вместимостью 10 см³. Доводят до метки метанолом, перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

СрокхранениярастворовпритемпературеотминусЗО °Сдоминус40 °С — не более одного года.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

Внутренние стандарты для трифенилметановых красителей выбирают в соответствии с таблицей 1.

Таблице 1 — Соответствие между внапитвми и внутренними стандартами

Наименование аиалмта	Наименование внутреннего стандарта
Малахитовый зеленый	Малахитовый зеленый-05
Кристаллический фиолетовый	Кристаллический фиолетовый-06
Бриллиантовый зеленый

6.3.4 Приготовление рабочих растворов внутренних стандартов О,. О_г

Рабочие растворы О,. 0₂ готовят в мерных колбах вместимостью 10 см³ согласно рисунку 2.

Прочий расп^внутренншстшшвртав а типовой концентрацией квадого аншмт $0 миЛы*	Рвбсчнйрвстворвиутре+мастаицартое Oj омаооовай ианцектрвдмй ввсдеге ЖВЛИТВ D,1 IBOfOM3
Берут по 0.1 си* каждого растворе	Берут по 0,2 <*а каждого растворе Сц

г:~……… *

Доводит до мели аштанолом, гмрввмшимшт

Пыигдихт ■ утътрамувжэю баню ив 1 мин

Рисунок 2 — Приготовление рабочих растворов внутренних стандартов О,. 0₂

Растворы D,. D₂ хранят при температуре от минус 30 *С до минус 40 ‘С. Срок хранения раствора D, — не более одного года. 0₂ — не более 3 мес.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.5 Приготовление матричных градуировочных растворов G,—G_e

Матричные градуировочные растворы G,—G_e готовят еполипропиленовыхлробирках вместимостью 15 см³ из «чистых» проб массой 1.0 г. в которые вносят рабочий раствор внутренних стандартов D₂ и рабочий раствор определяемых аналитов С₂ в соответствии с таблицей 2.

6

ГОСТ Р 56962—2016

Таблица 2 — Приготовление матричных градуировочных растворов <3,—G„

Обозначение и массовая концентрация приготовляемого матричного градуиро* вечного раствора	Вносимый объем рабочего раствора. cmj
с,	О,
G, (8 нг/СМ3)	0.16	0.05
<32 (6 нг/см3)	0.12	0.05
<53{4 нг/см3)	0.08	0.05
G4 {2 нг/см3)	0.04	0.05
6,(1 нг/см3)	0.02	0.05
<36<0.S нг/см3)	0.01	0.05

Пробирки встряхивают в шейкере 1 мин и проводят обработку пробы согласно разделу 7. Растворы G,—G_e используют свежеприготовленными.

7 Отбор и подготовка проб

7.1 Отбор проб

7.1.1 Отбор проб рыбы, нерыбных объектов (ракообразные, моллюски) и продукции из них — по ГОСТ 31339.

7.1.2 Пробы, отобранные по 7.1.1, при отсутствии возможности анализа в день отбора замораживают и хранят при температуре минус 18 ®С до проведения анализа, но не более 90 сут.

7.2 Подготовка проб

7.2.1 Экстракция и обезжиривание проб

Пробу предварительно очищают от грубой соединительной ткани, хитина, других нецелевых составляющих и измельчают на гомогенизаторе. Далее обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 3.

7

ГОСТ Р 56962—2016

РисунокЗ — Экстракция и обезжиривание проб

7.2.2 Очистка подготовленных проб методом ТФЭ

Картриджи для твердофазной экстракции кондиционируют на вакуумном устройстве для ТФЭ, про* пуская 2 см³ метанола и 2 см³ вспомогательного раствора ВР1 (см. 6.2.8.1). Затем пропускают через картридж пробу, полученную в соответствии с 7.2.1. промывают картридж, последовательно пропуская вспомогательные растворы по 3 см³: ВР2 (см. 6.2.8.2). ВРЗ (см. 6.2.8.3), ВР4 (см. 6.2.8.4), и сушат его в вакууме водоструйного наооса 2 мин. Элюируют определяемые вещества в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ с помощью Зсм³ вспомогательного раствора ВР5 (см. 6.2.8.5). Упарива-ют эл юат досуха в токе азота при температуре 50 *С. Остаток растворяют в 1 см³ вспомогательного раствора ВР6 (см. 6.2.8.6), перемешивают в шейкере, помещают в ультразвуковую баню при комнатной температуре на 2 мин и снова перемешивают е шейкере. Раствор фильтруют шприцем через мембранный фильтр в виалу вместимостью 2 см³ и используют для СВЭЖХ-ВПМС/МС анализа.

8 Порядок выполнения анализа

8.1 Условия хроматографических измерений

8.1.1 Масс-спектрометр с времяпропетнымдетекторомвысокогораэрешениявключаютесоотее-тстеии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые

8

ГОСТ Р 56962—2016

изготовителем хроматографических колонок. Например, для колонки диаметром 1 мм. длиной 50 мм. с гибридным обращекнофазным сорбентом с размером частиц 1.7 мкм. применяют следующие хроматографические условия:

• температура колонки — 30 *С;

• скорость потока подвижной фазы — 0.1 см³/мин;

• объем вводимой пробы — 10 мм³;

• температура в отсеке устройства ввода проб — 20 *С.

8.1.2 Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление растворов эпю-ектов по 6.2.1} в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3 — Условия хроматографического разделения

Время, ним	Подвижная фаза «А», %	Подвижная фаза «Б».Ч
0.0	100	—
1.0	100
1.1	S0	S0
7.0	10	90
10.0	10	90
10.1	100	—
16.0	100	—

8.1.3 Параметры воздействия на ионы в режиме мониторинга нескольких реакций (MRM) приведены в таблице 4.

Таблица 4 — Параметры воздействия на ионы а режиме MRM и условиях элехтрораспыления

Наименование аналитэ	Ион- предшественник, т/г	Иои-продукт. т/г	бремя удержи* вами я. ми и	Энергия соударений. эв
Малахитовый зеленый	329.20S	313.173	264.142	3.40	55
Малахитовый зеленый-05	335.237	316.204	246.134	3.14	55
Кристаллический фиолетовый	372,247	356.215	340.183	3.70	60
Кристаллический фиолетовый-Об	378.265	362.252	346.220	3.70	60
Бриллиантовый зеленый	385.268	341.204	297.140	4.24	60

Примечание — Приведенные выше параметры хроматографического разделения и мвсс-спектромет-рического детектирования могут отличаться в зависимости от используемой аппаратуры.

8.1.4 Параметры настройки времяпролетного масс-слектрометрического детектора:

• напряжение е источнике —500 В:

• напряжение на распыляющем капилляре — 4500 В;

• давление азота в распылителе — 300 кПа:

• скорость газа осушения — 8дм³/мин;

• температура газа осушения — 200 *С;

• высокочастотное напряжение на воронке — 400 В;

• амплитуда напряжения ВЧ — 400 В;

• амплитуда напряжения ВЧ ячейки соударений — 550 В.

Параметры источника электрораспыления приведены в таблице 5.

9

ГОСТ Р 56962—2016

Таблица 5 — Параметры источника электрораспыления

Временной интервал (ыии)	Амплитуда напряжения ВЧ охладителя ионов (Vpp>	Время транспортирования (цх)	время накопления ионов (и*)	Скорость скаиироеа-иия/режиы сканирования
0.50—3.45	80	35	15	2.S Гц/MRM
3.45—10.00	120	3S	15	3.0 Гц/MRM
14.00—15.50	50	50	10	1.0 Гц/MS

8.1.5 Контроль чувствительности масс-спектрометра осуществляют введением 10 мм³ градуировочного раствора G₃ (см. 6.3.5} в инжектор хроматографа. Полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 50.

8.2 Построение градуировочной характеристики

Построение и расчет градуировочной характеристики проводят методом внутреннего стандарта в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения масс-спектрометра в автоматическом режиме.

8.2.1 Проводят измерения не менее трех градуировочных растворов, приготовленных по 6.3.5. в порядке возрастания их концентраций.

8.2.2 В целях контроля стабильности градуировочной характеристики вместе с градуировочными растворами проводят дололительное измерение «чистой» пробы с добавкой трифенилметановых красителей на градуировочном уровне G_s

8.2.3 Вычисление площади лика проводят для наиболее интенсивного дочернего иона анализируемых трифенилметановых красителей и их внутренних стандартов. Для подтверждения наличия трифенилметановых красителей рассчитывают отношения площади пика двух дочерних ионов для каждого аналита в градуировочном растворе.

8.2.4 При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида у = эх. при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0.98.

8.2.5 Построение линейного градуировочного графика и расчет концентрации трифенилметано-вых красителей в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.

8.3 СВЭЖХ-ВПМС/МС-измеремие

8.3.1 Для определения остаточного содержания трифенилметановых красителей проводят СВЭЖХ-ВПМС/МС-анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования в условиях хроматографических измерений с параметрами, указанными в 8.1.

8.3.2 СВЭЖХ-ВПМС/МС-анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:

— экстракты «чистых» проб, приготовленных по 7.2;

• градуировочные растворы (см. 6.3.5);

— экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.

8.3.3 В инжектор хроматографа вводят 10 мм³ пробы, подготовленной в соответствии с разделом 7. и проводят измерения вусловиях, используемых при установлении градуировочной зависимости.

8.3.4 Отклонения относительных ионных интенсивностей в анализируемой пробе от относительных ионных интенсивностей, полученных при анализе градуировочных растворов, не должны превышать значений, указанных в таблице 6.

Таблице 6 — Допустимые отклонения относительных ионных интенсивностей

Относительная ионная интенсивность. % от основного пика	Максимально допустимые отклонения для СВЭЖХ-МСЛйС-детектироеания. 14
Св. 50	=25
Св. 20 до 50 включ.	хЗО
Св. 10 до 20 включ.	=35
Менее Ю	=50

10

ГОСТ Р 56962—2016

9 Обработка результатов измерений

9.1 В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения концентра’ ции аналитов в анализируемой пробе.

9.2 Содержание /-го аналита Х₍. мкг/кг. вычисляют по формуле

у — ^с, Ц (2)

где С, — концентрация аналита в анализируемой пробе, найденная по градуировочному графику, нг/см³;

V) — объем, до которого разбавлена проба, см³; т. — масса анализируемой пробы, г.

9.3 За окончательный результат содержания трифенилметановых красителей принимают среднеарифметическое значение результатов вычислений двух параллельных измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до первого десятичного знака и выраженное в микрограммах на килограмм (мкг/кг).

10 Метрологические характеристики

Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания трифенилметановых красителей с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к — 2. указанной в таблице 7.

Таблица 7 — Показатели точности метода при определении содержания трифенилметановых красителей

Наименование аналита	Диапазон изыере-ний содержания аналита, мкг/м	Значение отнеси* тельной расширенной неопределенное ти 4 U при коэффициенте охват» к • 2. %	Показатель по а торя • емости {относительное среднеквадратичен кое отклонение повторяемости) л г. %	Показатель воспроизводимости {относительное стандартное отклонение воспроизводи, мости) nft. %	Предел повторяемости г .4 {при Р • 0.95. л — 2)
Малахитовый зеленый	От 0.5 до 1.0 включ.	83	13	40	36
Св.1.0 до 2.0 включ.	S5	10	27	28
Св. 2.0 до 6.0 включ.	26	6	12	14
Бриллиантовый зеленый	От 0.5 до 2.0 включ.	70	26	33	72
Св. 2.0 до 4.0 включ.	33	10	15	26
Св. 4.0 до 6.0 включ	23	6	9	17
Криствлличвс-кий фиолетовый	От 0.5 до 1.0 включ.	80	32	46	73
Св.1.0 до 2.0 включ.	55	14	26	39
Св. 2.0 до 4.0 включ.	34	11	15	31
Св. 4.0 до 6.0 включ	24	5	10	14

11

ГОСТ Р 56962—2016

11 Оформление результатов измерений

Содержание /-го трифенилметаноеого красителя, мкг/кг. представляют в виде

7,10.01^-7,, (3)

где X, — среднеарифметическое значение вычислений двух параллельных измерений содержания но аналита в анализируемой пробе по 9.2, мкг/кг;

U/ — значение относительной расширенной неопределенности содержания ьтс аналита для соответствующего диапазона измерений. % (в соответствии с таблицей 7).

12 Контроль стабильности результатов измерений

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6 с использованием контрольных карт Шухарта.

УДК 639.38:614.31:543.062:006.351 ОКС 67.120.30

Ключевые слова: рыба, нерыбные объекты, остаточное содержание, трифенилметановые красители, сверхвысокозффективная жидкостная хроматография с еремяпролетным масс-слектрометрическим детектором высокого разрешения, малахитовый зеленый, лейкомалахитовый зеленый, кристаллический фиолетовый, бриллиантовый зеленый

Редактор Н.Н. Мжуноеа Технический редактор 6.Ю. Фотивва Корректор U.4. Першина Компьютерная верстка АН. Золотаревой

Сдано в набор 05 07.2016. Подписано в печать 08 08 2016. Формат 60 «84^. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1,66. Уч.’иад. л. 1.46. Тираж 31 экэ. Зак. 1641.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Издано и отпечатано во . 123965 Москва. Гранатный лер.. 4.