ГОСТ Р ИСО 10718-2005 Пробки корковые. Метод определения количества колоний живых микроорганизмов, способных расти в спиртовой среде

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО

ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

ПРОБКИ КОРКОВЫЕ

Метод определения количества колоний живых микроорганизмов, способных расти в спиртовой среде

ISO 10718:2002 Cork stoppers — Enumeration of colony-forming units of yeasts, moulds and bacteria capable of growth in an alcoholic medium (IDT)

Издание официальное

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

• 1 ПОДГОТОВЛЕН И ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 415 «Средства укупорочные» на основе собственного аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 3

• 2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 июля 2005 г. № 198-ст

• 3 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 10718:2002 «Корковые пробки — Определение количества колониеобразующих единиц дрожжевых грибов, плесневых грибов и бактерий, способных расти в спиртовой среде» (ISO 10718:2002 «Cork stoppers — Enumeration of colony-forming units of yeasts, moulds and bacteria capable of growth in an alcoholic medium»). Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р1.5—2004 (подраздел 3.5)

• 4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет

© Стандартинформ, 2005

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р ИСО 10718—2005

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОБКИ КОРКОВЫЕ

Метод определения количества колоний живых микроорганизмов, способных расти в спиртовой среде

Cork stoppers. Method for enumeration of colony-forming living microorganisms capable of growth in an alcoholic medium

Дата введения —• 2006—01—01

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения количества колониеобразующих единиц живых микроорганизмов — дрожжевых грибов, плесневых грибов и бактерий, которые могут существовать на корковых пробках и при определенных условиях могут расти в спиртовой среде.

Настоящий стандарт распространяется на корковые пробки, которые подвергались стерилизации.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт:

ГОСТ Р 51446—99 (ИСО 7218:1996) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочного стандарта в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) документом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Сущность метода заключается в определении количества колоний живых микроорганизмов (дрожжевых грибов, плесневых грибов и бактерий) с помощью инкубации в культуральной среде после извлечения их из спиртового раствора, содержащего винную кислоту, путем мембранной фильтрации.

4 Реактивы и культуральные среды

• 4.1 Рекомендуемый физиологический раствор (0,85%-ный NaCI) или раствор Рингера (1/4Х) следующего состава:

хлорид натрия 2,25 г/л;

хлорид калия 0,105 г/л;

хлорид кальция-6НгО(СаС12 6Н2О) 12 г/л;

бикарбонат натрия 0,05 г/л;

конечный pH (полученный определением в смеси) 7,0 ± 0,2.

Издание официальное

состава: дрожжевой экстракт 9,0 г/л;

глюкоза (церелоза) 50,0 г/л;

пептон 10,0 г/л;

сульфат магния 2,10 г/л;

фосфат калия 2,0 г/л;

диастаза (амилаза) 0,05 г/л;

тиамин 0,05 г/л;

бромкрезол 0,026 г/л;

конечный pH (полученный определением в смеси) 4,6 ± 0,2.

• 4.4

  Винная кислота.

  Этиловый слирт, 96%-ный. Поверхностно-активное вещество. Триптановый гель.

  Дифенил.

• 4.5

• 4.6

• 4.7

• 4.8

Реактивы и культуральные среды хранят в соответствии с рекомендациями производителя.

5 Аппаратура

Рекомендуемая микробиологическая лабораторная аппаратура указана ниже.

• 5.1 Система мембранной фильтрации.

Рекомендуется использовать одну из систем мембранной фильтрации, указанных в 5.1.1 и 5.1.2.

• 5.1.1 Стерильная фильтрационная система, готовая в применению, включающая полипропиленовую воронку вместимостью не менее 100 мл, стерильную мембрану (пористостью 0,45 мкм), стерильную чашку и вакуумный насос с трехходовым краном для его отключения.

• 5.1.2 Традиционная фильтрационная система, включающая воронку минимальной вместимостью 100 мл (из нержавеющей стали, стекла или поликарбоната), которая может быть простерилизована в автоклаве или 8 печи, стерильную мембрану (пористостью 0,45 мкм), стерильную чашку Петри с фильтровальной бумагой и вакуумный насос.

• 5.2 Термостат, температура которого может поддерживаться на уровне (30 ±2) °C.

• 5.3 Холодильник, температура в котором может поддерживаться от 2 °C до 8 °C.

• 5.4 Орбитальный шейкер с планшетным или круговым вибратором, установленный на скорость от 140 до 160 об/мин, или возвратно-поступательный шейкер, который может быть установлен на скорость от 140 до 160 движений вперед и назад.

• 5.5 pH-метр с температурной компенсацией, точностью ± 0,1 при 25 °C.

• 5.6 Стеклянные колбы с винтовыми крышками соответствующей вместимостью, позволяющей поместить четыре пробки в 100 мл раствора.

6 Отбор проб

Отбор проб проводят в асептических условиях.

Образцы (пробы) до проведения испытаний хранят в стерильных сосудах при температуре от 2 °C до 8 ^вС.

7 Условия испытаний

Подготовку материалов к испытаниям и сами испытания проводят в асептических условиях и в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51446.

8 Экстрагирование

• 8.1 Готовят физиологический раствор или раствор Рингера (4.1). При перемешивании добавляют поверхностно-активное вещество (4.6) до получения концентрации 10 г/л, а затем добавляют триптановый гель (4.7) до получения концентрации 1 г/л. После этого с помощью винной кислоты (4.4) доводят pH до 3—3,5. Наливают в каждую колбу (5.6) примерно по 90 мл раствора и подвергают стерилизации.

• 8.2 После охлаждения в каждую колбу в асептических условиях добавляют по 10 мл этилового спирта (4.5).

• 8.3 Помещают в каждую колбу по четыре корковых пробки так, чтобы они были полностью погружены в раствор. Встряхивают колбы в течение 1 ч со скоростью от 140 до 160 об/мин при температуре от 20 °C до 25 °C.

Число колб зависит от выбранной схемы отбора проб. Половину колб используют для посева на рекомендуемую среду WLD, другую половину — для посева на рекомендуемую среду M-Green. Для каждой культуральной среды готовят дополнительную колбу для контрольного опыта.

9 Проведение испытаний

• 9.1 Общие рекомендации

Испытания проводят в соответствии с 9.2 с использованием стерильной фильтрационной системы и стерильных культуральных сред, готовых к применению, а затем в соответствии с 9.3, используя фильтрационную систему, которую предстоит стерилизовать, и обезвоженные культуральные среды.

• 9.2 Экспресс-определение с использованием фильтрационной системы и готовых к применению стерильных культуральных сред

  • 9.2.1 Подготовка

Готовят фильтрационную систему (5.1.1).

• 9.2.2 Посев на рекомендуемую среду WLD

Подсоединяют наполненную воронку со стерильной мембраной к фильтрационной головке вакуумного насоса. В асептических условиях фильтруют экстракционный раствор, приготовленный в соответствии с разделом 8. В конце фильтрации отключают вакуум от линии отсасывания, чтобы установить равновесие с атмосферным давлением.

Непосредственно перед посевом в рекомендуемую среду WLD (4.2) добавляют дифенил (4.8), растворенный в 10%-ном растворе этанола, чтобы достичь концентрации дифенила 30 ppm (млн^-1). Добавляют рекомендуемую среду WLD, содержащуюся 8 ампулах, ненадолго подключают к вакууму для отсасывания, затем отключают вакуум. Удаляют фильтрационную установку и вставляют пробку фильтрационной системы в ее основание, чтобы не допустить реинфицирования. Убирают цилиндрическую часть воронки. Крышку воронки помещают в систему фильтр/чашка Петри.

Повторяют эту процедуру с каждой колбой.

• 9.2.3 Посев на рекомендуемую среду M-Green

Подсоединяют наполненную воронку со стерильной мембраной к фильтрационной головке вакуумного насоса. В асептических условиях фильтруют экстракционный раствор, приготовленный в соответствии с разделом 8. В конце фильтрации отключают вакуум от линии отсасывания, чтобы установить равновесие с атмосферным давлением. Добавляют культуральную среду M-Green (4.3), содержащуюся в ампуле, ненадолго подключают к вакууму для отсасывания и затем отключают вакуум. Удаляют фильтрационную установку и вставляют пробку фильтрационной системы в ее основание, чтобы не допустить реинфицирования. Убирают цилиндрическую часть воронки. Крышку воронки помещают в систему фильтр/чашка Петри.

Повторяют эту процедуру с каждой колбой.

Обезвоженную культуральную среду вновь гидратируют с использованием стерилизованной и деминерализованной воды.

• 9.3 Определение с помощью стерилизованной фильтрационной системы и обезвоженных культуральных сред

  • 9.3.1 Подготовка рекомендуемых сред

Готовят и стерилизуют рекомендуемые среды WLD (4.2) и M-Green (4.3), следуя инструкциям производителя.

Добавляют дифенил (4.8), растворенный в 10%-ном растворе этанола, к среде WLD, чтобы достичь концентрации дифенила 30 ppm (млн^-1).

Готовят чашки Петри.

• 9.3.2 Подготовка фильтрационной системы

Стерилизуют и готовят фильтрационную систему (5.1.2).

• 9.3.3 Посев на рекомендуемую среду WLD

В асептических условиях фильтруют экстракционный раствор, приготовленный в соответствии с разделом 8, используя стерильную мембрану. Помещают мембрану на чашку Петри со средой WLD.

Повторяют процедуру с каждой колбой.

• 9.3.4 Посев на рекомендуемую среду M-Green

В асептических условиях фильтруют экстракционный раствор, приготовленный в соответствии с разделом 8, используя стерильную мембрану. Помещают мембрану на чашку Петри со средой M-Green.

Повторяют процедуру с каждой колбой.

10 Контрольные исследования

Готовят контрольные исследования для каждой среды.

11 Инкубация

Переворачивают чашки Петри со средами WLD и M-Green и выдерживают в термостате (5.2) при температуре (30 ± 2) °C в течение 3 дней.

Наблюдают за ростом и подсчитывают колонии на каждой чашке каждые 24 ч.

12 Обработка результатов

• 12.1 Определение числа КОЕ бактерий на корковой пробке

После окончания инкубации подсчитывают колонии бактерий на каждой чашке со средой WLD, каждый раз сравнивая результат с последним установленным показателем.

Для каждой чашки число колониеобразующих единиц (КОЕ) на корковой пробке определяют по следующей формуле где N_b — общее число подсчитанных колоний бактерий;

4 — число испытываемых корковых пробок.

За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение установленных показателей, полученных для каждой чашки, округленное в большую сторону до ближайшего целого числа.

• 12.2 Определение числа КОЕ дрожжевых и плесневых грибов на корковой пробке

После окончания инкубации подсчитывают колонии дрожжевых и плесневых грибов на каждой чашке со средой M-Green, каждый раз сравнивая результат с последним установленным показателем.

Для каждой чашки число колониеобразующих единиц (КОЕ) на корковой пробке определяют по следующей формуле

(2)

где N_{y т} — общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов;

4 — число испытываемых корковых пробок.

За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение установленных показателей, полученных для каждой чашки, округленное в большую сторону до ближайшего целого числа.

13 Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен содержать следующую информацию:

• a) ссылку на настоящий стандарт;

• b) данные отбора проб и критерии идентификации образца;

• c) дату проведения испытаний и полученные результаты;

• d) все подробности проведения испытаний, не указанные в настоящем стандарте, или любых выбранных операций;

• e) любые факторы, которые могли оказать неблагоприятное влияние на результаты испытаний.

УДК 683.531.13:006.354 ОКС 55.040 Д97 ОКП 92 9983

Ключевые слова: корковые пробки, микроорганизмы, колониеобразующие единицы (КОЕ) дрожжевых грибов, плесневых грибов и бактерий

Редактор П.И. Нахимова Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор М.И. Першина Компьютерная верстка И.А. Налвйкиной

Сдано в набор 02.08.2005. Подписано в печать 12.08.2005. Формат 60 х 84 %. Бумага офсетная. Гарнитура Ариал. Печать офсетная. Усл. печ.л. 0,93-Уч.-иэд.п. 0,70. Тираж 180 экз. Зак. 553. С 1671.

ФГУП «Стандартинформ», 123995 Москва, Гранатный пер.. 4. info@gostinf6.ru Набрано во ФГУП «Стандартинформ» на ПЭВМ

Отпечатано в филиале ФГУП «Стандартинформ» —тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Ляпин пер., 6.